ΕΕ2 Νυμφικές εκτροφές και παραγωγή γόνου
Περιγραφή Ενότητας Εργασίας
Αφού εξασφαλιστεί η παραγωγή αυγών, το επόμενο στάδιο είναι η νυμφική εκτροφή και η παραγωγή γόνου, μέσω της ΕΕ2 Νυμφικές εκτροφές και παραγωγή γόνου. Με τις τρέχουσες τεχνολογίες νυμφικής εκτροφής το μαγιάτικο εμφανίζει χαμηλή επιβίωση. Η εκτροφή πραγματοποιείται κάτω από υψηλές καλοκαιρινές θερμοκρασίες, ενώ η εμπειρία και η τεχνολογία της βιομηχανίας των εκκολαπτηρίων βασίζεται κυρίως στην εκτροφή τσιπούρας και λαβρακιού, που εκτρέφονται σε χειμερινές θερμοκρασίες. Συνεπώς η τροποποίηση των πρωτοκόλλων νυμφικών εκτροφών στα οποία περιλαμβάνονται και τα διατροφικά πρωτοκόλλα κρίνεται άμεσα αναγκαία. Η βελτίωση των υφιστάμενων πρωτόκολλων νυμφικής εκτροφής θα γίνει με βάση την οντογένεση του πεπτικού συστήματος και της όρασης, και της προτίμησης ειδών τροφής. Θα γίνει επίσης χρήση κωπηπόδων τις πρώτες μέρες εξωγενούς θρέψης, αφού τα κωπήποδα παρουσιάζουν το πλεονέκτημα ότι τα λιπαρά οξέα εικοσιδιεξανοικό οξύ (DHA) και εικοσιπεντενικό οξύ (EPA) που είναι σημαντικά για την σωστή ανάπτυξη της όρασης και του νευρικού συστήματος βρίσκονται στα φωσφολιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών των κωπηπόδων. Θα γίνει επίσης αξιολόγηση της χρήσης προβιοτικών στην νυμφική εκτροφή, τα οποία είναι ζωντανοί μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την επίτευξη της μικροβιακής ισορροπίας της μικροχλωρίδας του ξενιστή, στην προκειμένη περίπτωση των εκτρεφόμενων νυμφών. Κατά την διάρκεια των διαφόρων εκτροφών, θα γίνει περιγραφή του μικροβιώματος και μελέτη των πρωτεϊνών μελών των οικογενειών των HSPs και MAPKs των νυμφών σε σχέση με την διατροφή τους. Ο χαρακτηρισμός της συνολικής σύστασης των μικροοργανισμών που απαντώνται στο γαστρενετρικό σωλήνα καθώς και η διατήρηση αυτού του μικροβιώματος, θεωρείται σήμερα το πρώτο και σημαντικότερο βήμα για περαιτέρω μελέτες σε σχέση με την υγεία και ευεξία του οργανισμού. Τέλος, θα γίνει περιγραφή της ανάπτυξης του σκελετού και των μορφοανατομικών παραμορφώσεων σε σχέση με το πρωτόκολλο εκτροφής, αφού οι παραμορφώσεις στο μαγιάτικο δεν έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, και δεν είναι γνωστό σε ποιους τομείς παρουσιάζει ευπάθεια κατά την εκτροφή του.
Εργασίες και Παραδοτέα
Εργασία 2.1 Χρήση κωπηπόδων τις πρώτες μέρες εξωγενούς θρέψης (ΠΠ)
Παραδοτέο 2.1.1. Χρήση κωπηπόδων σε πείραμα μικρής κλίμακας νυμφικής εκτροφής (M12)
Εργασία 2.2 Βελτίωση των υφιστάμενων πρωτόκολλων νυμφικής εκτροφής με βάση την οντογένεση του πεπτικού συστήματος και της όρασης (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.2.1. Περιγραφή της οντογένεσης του πεπτικού συστήματος και του ματιού στο μαγιάτικο και της διατροφικής προτίμησης, και πρόταση βελτιωμένου πρωτοκόλλου εκτροφής (Μ12)
Παραδοτέο 2.2.2. Αξιολόγησή του βελτιωμένου πρωτοκόλλου, και συγκριτικά με την χρήση προβιοτικών και κωπηπόδων στο διατροφικού πρωτόκολλο (Μ32).
Παραδοτέο 2.2.3. Τελική διαμόρφωση του διατροφικού πρωτόκολλου νυμφικής εκτροφής του μαγιάτικου (Μ34).
Εργασία 2.3 Χρήση προβιοτικών στην νυμφική εκτροφή (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.3.1. Χρήση βιολογικών φίλτρων με Phaeobacter sp. (M24)
Παραδοτέο 2.3.2. Χρήση προβιοτικών στη ζωντανή τροφή (M33)
Εργασία 2.4 Περιγραφή του μικροβιώματος και μελέτη των πρωτεϊνών μελών των οικογενειών των HSPs και MAPKs των νυμφών (ΤΓΙΥΠ, ΑΠΘ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.4.1. Έκθεση βιβλιογραφικής επισκόπησης για το εντερικό μικροβίωμα σε εκτρεφόμενα μεσογειακά είδη ψαριών (Μ30)
Παραδοτέο 2.4.2. Περιγραφή του εντερικού μικροβιώματος στο μαγιάτικο κατά τη νυμφική εκτροφή του και την εμπλοκή τους σε αντίστοιχα μεταβολικά μονοπάτια φυσιολογίας θρέψης (Μ34)
Παραδοτέο 2.4.3. Πρότυπο πρωτεϊνικής έκφρασης μελών της οικογένειας των MAPKs και HSPs κατά τη διάρκεια της νυμφικής εκτροφής (Μ35)
Εργασία 2.5 Περιγραφή της ανάπτυξης του σκελετού και των μορφοανατομικών παραμορφώσεων σε σχέση με το πρωτόκολλο εκτροφής (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.5.1. Πρότυπο ανάπτυξης σκελετού στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής (Μ30)
Παραδοτέο 2.5.2. Εμφάνιση σκελετικών παραμορφώσεων στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής (Μ32)
Εργασία 2.6 Διάχυση αποτελεσμάτων νυμφικών εκτροφών και παραγωγής γόνου (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΠΠ, ΤΓΙΥΠ και ΑΠΘ)
Παραδοτέο 2.6.1. Εκλαϊκευμένα άρθρα αποτελεσμάτων νυμφικών εκτροφών και παραγωγής γόνου (Μ30)
Παραδοτέο 2.1.1. Χρήση κωπηπόδων σε πείραμα μικρής κλίμακας νυμφικής εκτροφής (M12)
Εργασία 2.2 Βελτίωση των υφιστάμενων πρωτόκολλων νυμφικής εκτροφής με βάση την οντογένεση του πεπτικού συστήματος και της όρασης (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.2.1. Περιγραφή της οντογένεσης του πεπτικού συστήματος και του ματιού στο μαγιάτικο και της διατροφικής προτίμησης, και πρόταση βελτιωμένου πρωτοκόλλου εκτροφής (Μ12)
Παραδοτέο 2.2.2. Αξιολόγησή του βελτιωμένου πρωτοκόλλου, και συγκριτικά με την χρήση προβιοτικών και κωπηπόδων στο διατροφικού πρωτόκολλο (Μ32).
Παραδοτέο 2.2.3. Τελική διαμόρφωση του διατροφικού πρωτόκολλου νυμφικής εκτροφής του μαγιάτικου (Μ34).
Εργασία 2.3 Χρήση προβιοτικών στην νυμφική εκτροφή (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.3.1. Χρήση βιολογικών φίλτρων με Phaeobacter sp. (M24)
Παραδοτέο 2.3.2. Χρήση προβιοτικών στη ζωντανή τροφή (M33)
Εργασία 2.4 Περιγραφή του μικροβιώματος και μελέτη των πρωτεϊνών μελών των οικογενειών των HSPs και MAPKs των νυμφών (ΤΓΙΥΠ, ΑΠΘ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.4.1. Έκθεση βιβλιογραφικής επισκόπησης για το εντερικό μικροβίωμα σε εκτρεφόμενα μεσογειακά είδη ψαριών (Μ30)
Παραδοτέο 2.4.2. Περιγραφή του εντερικού μικροβιώματος στο μαγιάτικο κατά τη νυμφική εκτροφή του και την εμπλοκή τους σε αντίστοιχα μεταβολικά μονοπάτια φυσιολογίας θρέψης (Μ34)
Παραδοτέο 2.4.3. Πρότυπο πρωτεϊνικής έκφρασης μελών της οικογένειας των MAPKs και HSPs κατά τη διάρκεια της νυμφικής εκτροφής (Μ35)
Εργασία 2.5 Περιγραφή της ανάπτυξης του σκελετού και των μορφοανατομικών παραμορφώσεων σε σχέση με το πρωτόκολλο εκτροφής (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 2.5.1. Πρότυπο ανάπτυξης σκελετού στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής (Μ30)
Παραδοτέο 2.5.2. Εμφάνιση σκελετικών παραμορφώσεων στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής (Μ32)
Εργασία 2.6 Διάχυση αποτελεσμάτων νυμφικών εκτροφών και παραγωγής γόνου (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΠΠ, ΤΓΙΥΠ και ΑΠΘ)
Παραδοτέο 2.6.1. Εκλαϊκευμένα άρθρα αποτελεσμάτων νυμφικών εκτροφών και παραγωγής γόνου (Μ30)
Αναλυτική περιγραφή εργασιών
Εργασία 2.1 Χρήση κωπηπόδων τις 2-3 πρώτες μέρες εξωγενούς θρέψης (ΠΠ, ΙΘΑΒΥΚ)
Στο πείραμα που θα πραγματοποιηθεί στο ΠΠ θα ταϊστούν νύμφες μαγιάτικου σε σύστημα εκτροφής σε κυλινδροκωνικές δεξαμενές 200 λίτρων χρησιμοποιώντας τις κλασική τροφική αλυσίδα (μικροφύκη, τροχόζωα., Artemia) και στην ομάδα χειρισμού θα προστεθούν αποψυγμένα κωπήποδα τις 3-4 πρώτες μέρες της εξωγενούς διατροφής. Θα πάρουμε δείγματα για να ελεγχθεί η ανάπτυξη του οφθαλμού, του πεπτικού συστήματος με τη χρήση ιστολογίας, δείγματα για ανάλυση έκφρασης γονίδιων σχετικών με την παραγωγή πεπτικών ενζύμων, δείγματα για τη μελέτη των σκελετικών δυσμορφιών και δείγματα μικροβιολογίας. Το πείραμα θα ολοκληρωθεί περίπου τρεις εβδομάδες μετά την εκκόλαψη και θα γίνει καταμέτρηση των ιχθυονυμφών και σύγκριση επιβίωσης και ανάπτυξης μεταξύ των δυο ομάδων (εκτροφή με/χωρίς κωπήποδα).
Εργασία 2.2 Βελτίωση των υφιστάμενων πρωτόκολλων νυμφικής εκτροφής με βάση την οντογένεση του πεπτικού συστήματος και της όρασης (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Α. Αρχικό πρωτόκολλο εκτροφής (πρώτος χρόνος του έργου).Σε συνεργασία με την εταιρία ΓΑΛΑΞΙΔΙ θα οργανωθεί ένα πρωτόκολλο που θα είναι βασισμένο σε εκτροφή του είδους αυτού από βιβλιογραφικές αναφορές αλλά και από εμπειρία του ΙΘΑΒΒΥΚ σε σχετικές μελέτες πάνω σε αυτό το είδος. Το αρχικό πρωτόκολλο θα εφαρμοστεί σε 2 δεξαμενές χωρητικότητας 10 m3. Δείγματα νυμφών προς μελέτη θα παρθούν 2 ώρες μετά το πρωινό τάισμα των ψαριών και αφού έχουν χορηγηθεί όλοι οι τύποι των τροφών που συμπεριλαμβάνονταν στο εκάστοτε ημερήσιο πρωτόκολλο διατροφής σε κάθε πρωτόκολλο εκτροφής. Δείγματα 10 ατόμων θα παίρνονται σε τακτά διαστήματα (1-2 ημέρες) και θα διατηρηθούν σε διάλυμα 4% formaldehyde: 1% gluteraldehyde για τις εργαστηριακές μελέτες. Τα πειράματα του πρώτου χρόνου θα αποσκοπούν στην ανάπτυξη ενός βέλτιστου πρωτόκολλου νυμφικής εκτροφής, με βάση (α) την οντογένεση του πεπτικού συστήματος και του ματιού, (β) την διατροφική προτίμηση σε σχέση με το διατροφικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε και (γ) την ύπαρξη περιόδων υποσιτισμού και προβληματικής αξιοποίησης των προσφερόμενων ειδών τροφής (τροχόζωα, Artemia και βιομηχανική τροφή).
Β. Βελτιωμένο πρωτόκολλο εκτροφής (δεύτερος χρόνος του έργου). Από τα αποτελέσματα του πρώτου έτους θα φτιαχτεί ένα βελτιωμένο πρωτόκολλο που θα βασίζεται στην ανάλυση των ιστολογικών δεδομένων και θα αφορούν τον συγχρονισμό της ανάπτυξης των βασικών δομών των δυο κύριων συστημάτων του οργανισμού, του πεπτικού συστήματος και του ματιού, με το διατροφικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε. Επίσης, θα αξιολογηθεί η διατροφική προτίμηση σε σχέση με το διατροφικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε και θα προσδιοριστούν και πάλι τυχόν περίοδοι υποσιτισμού και προβληματικής αξιοποίησης των προσφερόμενων ειδών τροφής. Το βελτιωμένο αυτό πρωτόκολλο θα χρησιμοποιηθεί στις εκτροφές του δεύτερου έτους, που θα περιλαμβάνουν και δοκιμές με την χρήση προβιοτικών τόσο στο νερό όσο και στην τροφή (Εργασία 2.3). Όπως και τον πρώτο χρόνο, δείγματα 10 ατόμων θα συλλεχθούν σε τακτά διαστήματα και θα διατηρηθούν σε διάλυμα 4% formaldehyde: 1% gluteraldehyde για εργαστηριακές αναλύσεις. Από τις εκτροφές του δεύτερου έτους θα γίνει αξιολόγησή του βελτιωμένου πρωτοκόλλου και σύγκριση με το αρχικό του πρώτου έτους, αλλά και συγκριτικά με την χρήση ή μη των προβιοτικών.
Γ) Εργαστηριακές μελέτες (δεύτερος και τρίτος χρόνος του έργου). Η μελέτη της οντογένεσης του πεπτικού συστήματος και ματιού θα πραγματοποιηθεί με χρήση μικροσκοπίου και στερεοσκοπίου, όπου στις ιστολογικές τομές νυμφών θα εντοπιστεί η κάθε δομή του αντίστοιχου συστήματος. Η μελέτη της οντογένεσης του πεπτικού συστήματος και ματιού αποσκοπεί στην χρονική χαρτογράφηση της εμφάνισης των δομών που αποτελούν κάθε σύστημα.
Για τον υπολογισμό του ποσοστού κάλυψης ιστολογικών τομών συκωτιού με λίπος θα φωτογραφηθούν κάτω από μικροσκόπιο διαφορετικές περιοχές του συκωτιού, που θα επιλεχθούν τυχαία από αντίστοιχες διαφορετικές τομές της ίδιας νύμφης. Η μεθοδολογία ανάλυσης των φωτογραφιών αποσκοπεί στον εντοπισμό των περιόδων διατροφικής ευρωστίας ή καταπόνησης του οργανισμού από την αντίστοιχη διατήρηση σε ικανοποιητικά ποσοστά ή σημαντικής μείωσης του ποσοστού λίπους στο συκώτι των νυμφών (Papadakis et al., 2013; Papadakis et al., 2009). Για τη μελέτη του στομαχικού περιεχόμενου και της διατροφικής προτίμησης θα φωτογραφηθούν αντιπροσωπευτικές τομές ιχθυονυμφών στις ημέρες δειγματοληψίας. Στην συνέχεια, με την χρήση μικροσκοπίου και συστήματος ανάλυσης εικόνα θα προσδιοριστεί ο τύπος της τροφής που υπήρχε μέσα στο στομάχι, ώστε να περιγραφεί η διατροφική προτίμηση του είδους σε σχέση με την σύσταση του πρωτοκόλλου που υπήρχε την δεδομένη στιγμή. Δεδομένα που θα ληφθούν από το πρόγραμμα της ανάλυσης της εικόνας φωτογραφιών από ιστολογικές τομές του αμφιβληστροειδή καθώς και του φακού του ματιού θα χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της οπτικής ικανότητας των νυμφών του μαγιάτικου (Neave, 1984). Βάση αυτών των αποτελεσμάτων θα εκτιμηθεί και η απόσταση αντίληψης αντικειμένων συγκεκριμένου μεγέθους όπως θα μπορούσε να είναι το μέγεθος των τροχοζώων ή των ναυπλίων της Artemia, ώστε να αξιολογηθεί η καταλληλότητα της ποσότητας της τροφής που παρέχεται.
Εργασία 2.3 Χρήση προβιοτικών στην νυμφική εκτροφή (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Δυο πειράματα σχετικά με τα προβιοτικά θα πραγματοποιηθούν στο εκκολαπτήριο της ΓΑΛΑΞΙΔΙ. Στο πρώτο πείραμα στην ομάδα των προβιοτικών (δυο δεξαμενές των 4 κυβικών μέτρων) θα τοποθετηθούν βιολογικά φίλτρα 20 λίτρων που θα έχουν ειδικό κεραμικό υλικό (Fluval, Biomax) εμποτισμένο σε καλλιέργειεςPhaeobactersp. Θα γίνει εκτροφή των ιχθυονυμφών και δειγματοληψίες για τη μελέτη της μικροχλωρίδας του νερού, της ζωντανής τροφής και της εντερικής μικροχλωρίδας των ιχθυονυμφών για να ποσοτικοποιηθεί η παρουσία του προβιοτικού στο νερό και τη ζωντανή τροφή (δεν αποικίζει τις νύμφες), καθώς και την επίδραση του στη καλλιεργήσιμη και μη καλλιεργήσιμη μικροχλωρίδα του εντερικού σωλήνα. Στο τέλος της νυμφικής εκτροφής θα γίνει μια αξιολόγηση και εάν η επίδραση των βιολογικών φίλτρων κριθεί θετικά αυτά θα χρησιμοποιηθούν και στο επόμενο πείραμα.
Στο δεύτερο πείραμα θα χρησιμοποιηθούν βακτήρια τα οποία θα προστίθενται στη δεξαμενή εμπλουτισμού των τροχοζώων (ή της Artemia) για μισή ώρα πριν τη συγκομιδή τους και πριν το πλύσιμο και τάισμα στις δεξαμενές εκτροφής. Τα τροχόζωα και η Artemia έχουν την ικανότητα να βιο-εγκλείουν τα προβιοτικά βακτήρια και έτσι να μεταφέρουν κάποια προβιοτικά. Έτσι τα προβιοτικά εγκαθίστανται με έναν σχετικά απλό τρόπο στο πεπτικό σωλήνα και μπορούν να έχουν ένα θετικό αποτέλεσμα για τις ιχθυονύμφες. Οι δειγματοληψίες θα είναι παρόμοιες με το πρώτο πείραμα. Και στα δυο πειράματα θα μετρηθούν και ζωοτεχνικές παράμετροι όπως ανάπτυξη και επιβίωση. Θα γίνει επίσης ποσοτικοποίηση των προβιοτικών στις ιχθυονύμφες, στο νερό και στη ζωντανή τροφή.
Εργασία 2.4 Περιγραφή του μικροβιώματος και μελέτη των πρωτεϊνών μελών των οικογενειών των HSPsκαι MAPKsτων νυμφών (ΤΓΙΥΠ, ΑΠΘ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Ο πειραματικός σχεδιασμός θα περιλαμβάνει μελέτη δειγμάτων μεσεντέρων κατά τη νυμφική εκτροφή σε σχέση με τη διατροφή τους. Τα δείγματα με βάρος ιστού 0.5 g σε τρεις επαναλήψεις θα παρθούν ανα διαφορετική ημέρα εκτροφής την ημέρα 0 (εκκόλαψη), την ημέρα 3 (διατροφή με ρότιφερ), την ημέρα 18 (διατροφή με Artemia), την ημέρα 20 (διατροφή με σύμπηκτο), την ημέρα 34 (στάδιο νεαρού ιχθυδίου) και όταν θα είναι ιχθύδιο βάρους 1 g. O ιστός αυτός για τη μελέτη του μικροβιώματος (0.3 g) θα υπόκειται σε πλύση με απιονισμένο και αποστειρωμένο νερό και αποθήκευση των δειγμάτων σε υπερκατάψυξη (-80oC) μέχρι την εκχύλιση του DNA όπως σε προηγούμενες μελέτες (π.χ., Kormas et al., 2014; Mente et al., 2016). H προκαρυωτική ποικιλότητα του εντέρου θα προσδιοριστεί μέσω της ποικιλότητας του 16S rRNA γονιδίου (περιοχή V3-V4) μέσω αλληλούχισης επόμενης γενιάς (πλατφόρμα Illumina) και με τη χρήση εκκινητών ειδικών για τα Bacteria (βλ. Kormas et al. 2014; Mente et al. 2016). Για την μελέτη των πρωτεϊνών HSPsκαι MAPKsτων νυμφών θα χρησιμοποιηθούν 0.2 gαπό τα 0.5 g. Τα δείγματα θα καταψύχονται άμεσα σε υγρό άζωτο ή ξηρό πάγο. Ακολουθεί αποθήκευση σε υπερκατάψυξη (-80oC) μέχρι την εκχύλιση των πρωτεϊνών και ανοσοαποτύπωση κατά Westernblotόπως περιγράφεται σε προηγούμενες εργασίες (π.χ. Antonopoulouetal., 2013, 2014, 2017).
Τα δεδομένα που θα προκύψουν θα αναλυθούν ώστε να γίνει περιγραφή των μικροοργανισμών και εμπλοκή τους σε μεταβολικά μονοπάτια φυσιολογίας θρέψης. Η χρονική μεταβολή των εντερικών μικροβιοκοινοτήτων και η ημιποσοτική μέθοδος ανοσοανίχνευσης των πρωτεϊνικών δεικτών HSPsκαι MAPKs θα καταδείξει ποια βακτηριακά είδη έχουν μεγαλύτερη οικοφυσιολογική σημασία για τα νυμφικά στάδια (core microbiota). Επίσης ποια βακτηριακά είδη είναι ειδικά στα διάφορα στάδια και τη συσχέτισή τους με τις εξεταζόμενες πρωτεϊνες, ώστε να χρησιμοποιηθούν μελλοντικά τα βακτηριακά είδη στη διατροφή των ψαριών για την καλύτερη αφομοίωση των θρεπτικών συστατικών της ιχθυοτροφής. Βάσει των βακτηριακών ειδών και της φυσιολογικής απόκρισης που απαντώνται στο έντερο, θα διερευνηθούν, από βάσεις γονιδιωματικών δεδομένων μικροοργανισμών (in silico).
Εργασία 2.5 Περιγραφή της ανάπτυξης του σκελετού και των μορφοανατομικών παραμορφώσεων σε σχέση με το πρωτόκολλο εκτροφής (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Η επιτυχής υλοποίησης της ενότητας εργασίας αυτής βασίζεται στη σωστή δειγματοληψία των νυμφών:
Μελέτη ανάπτυξης του σκελετού. Από την εκκόλαψη των αυγών και καθ’ όλη τη διάρκεια της νυμφικής εκτροφής θα λαμβάνονται δείγματα περίπου 20 ατόμων κάθε 4 ημέρες. Τα άτομα θα συντηρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5% και θα αποθηκεύονται στο σκοτάδι. Η επεξεργασία των δειγμάτων αυτών θα γίνει μέσω διπλής χρώσης με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας ούτως ώστε να γίνει εφικτή η παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Θα πραγματοποιηθεί η μελέτη της οντογένεσης του σκελετού σε έναν πληθυσμό από κάθε μια από τις συνθήκες εκτροφής που θα πραγματοποιηθούν (κοινό πρωτόκολλο, χρήση προβιοτικών) και θα καταγραφεί τυχόν διαφοροποίηση στην ταχύτητα ανάπτυξης αυτού και στην τελική του εικόνα (μεριστικά).
Μελέτη παραμορφώσεων. Η εμφάνιση ή όχι παραμορφώσεων στους εκτρεφόμενους υπό διαφορετικές συνθήκες πληθυσμούς θα μελετηθεί σε δείγματα (100 ατόμων ανά μέθοδο εκτροφής ανά επανάληψη) που θα ληφθούν τυχαία α) στο στάδιο της κάμψης της νωτοχορδής (8-10 mm Ολικό Μήκος, ΟΜ) και β) στο τέλος της παραμόρφωσης (18-20 mm OM) και θα συντηρηθούν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5%. Για τη μελέτη των σκελετικών παραμορφώσεων θα ακολουθήσει διπλή χρώση των νυμφικών δειγμάτων με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας και παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί δειγματοληψία και σε ένα 3οστάδιο (ιχθύδια, >30mmTL) όπου η μελέτη του σκελετού των ψαριών θα γίνει με ακτινογραφίες (καθώς η χρώση σε τόσο μεγάλα δείγματα δεν αποδίδει). Πρέπει να τονιστεί ότι χρησιμοποιώντας τα δείγματα της προηγούμενης μελέτης (ανάπτυξη σκελετού), θα είναι εφικτή η ανάδρομη προσέγγιση του σταδίου όπου οι σκελετικές παραμορφώσεις. Επίσης, χρησιμοποιώντας τα δείγματα της προηγούμενης μελέτης, θα είναι εφικτή η ανάδρομη μελέτη του σταδίου όπου οι σκελετικές παραμορφώσεις αναπτύσσονται.
Εργασία 2.6 Διάχυση αποτελεσμάτων νυμφικών εκτροφών και παραγωγής γόνου (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΠΠ, ΤΓΙΥΠ, ΑΠΘ)
Με βάση τα αποτελέσματα της ΕΕ 2 στο τέλος κάθε έτους, θα αξιολογούνται οι δράσεις διάχυσης αποτελεσμάτων, με την συγγραφή, σε πρώτη φάση, εκλαϊκευμένων άρθρων σε επαγγελματικά περιοδικά του τομέα, την παρουσίαση αποτελεσμάτων σε διεθνή και εθνικά συνέδρια και την ετοιμασία δημοσιεύσεων σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά.
Στο πείραμα που θα πραγματοποιηθεί στο ΠΠ θα ταϊστούν νύμφες μαγιάτικου σε σύστημα εκτροφής σε κυλινδροκωνικές δεξαμενές 200 λίτρων χρησιμοποιώντας τις κλασική τροφική αλυσίδα (μικροφύκη, τροχόζωα., Artemia) και στην ομάδα χειρισμού θα προστεθούν αποψυγμένα κωπήποδα τις 3-4 πρώτες μέρες της εξωγενούς διατροφής. Θα πάρουμε δείγματα για να ελεγχθεί η ανάπτυξη του οφθαλμού, του πεπτικού συστήματος με τη χρήση ιστολογίας, δείγματα για ανάλυση έκφρασης γονίδιων σχετικών με την παραγωγή πεπτικών ενζύμων, δείγματα για τη μελέτη των σκελετικών δυσμορφιών και δείγματα μικροβιολογίας. Το πείραμα θα ολοκληρωθεί περίπου τρεις εβδομάδες μετά την εκκόλαψη και θα γίνει καταμέτρηση των ιχθυονυμφών και σύγκριση επιβίωσης και ανάπτυξης μεταξύ των δυο ομάδων (εκτροφή με/χωρίς κωπήποδα).
Εργασία 2.2 Βελτίωση των υφιστάμενων πρωτόκολλων νυμφικής εκτροφής με βάση την οντογένεση του πεπτικού συστήματος και της όρασης (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Α. Αρχικό πρωτόκολλο εκτροφής (πρώτος χρόνος του έργου).Σε συνεργασία με την εταιρία ΓΑΛΑΞΙΔΙ θα οργανωθεί ένα πρωτόκολλο που θα είναι βασισμένο σε εκτροφή του είδους αυτού από βιβλιογραφικές αναφορές αλλά και από εμπειρία του ΙΘΑΒΒΥΚ σε σχετικές μελέτες πάνω σε αυτό το είδος. Το αρχικό πρωτόκολλο θα εφαρμοστεί σε 2 δεξαμενές χωρητικότητας 10 m3. Δείγματα νυμφών προς μελέτη θα παρθούν 2 ώρες μετά το πρωινό τάισμα των ψαριών και αφού έχουν χορηγηθεί όλοι οι τύποι των τροφών που συμπεριλαμβάνονταν στο εκάστοτε ημερήσιο πρωτόκολλο διατροφής σε κάθε πρωτόκολλο εκτροφής. Δείγματα 10 ατόμων θα παίρνονται σε τακτά διαστήματα (1-2 ημέρες) και θα διατηρηθούν σε διάλυμα 4% formaldehyde: 1% gluteraldehyde για τις εργαστηριακές μελέτες. Τα πειράματα του πρώτου χρόνου θα αποσκοπούν στην ανάπτυξη ενός βέλτιστου πρωτόκολλου νυμφικής εκτροφής, με βάση (α) την οντογένεση του πεπτικού συστήματος και του ματιού, (β) την διατροφική προτίμηση σε σχέση με το διατροφικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε και (γ) την ύπαρξη περιόδων υποσιτισμού και προβληματικής αξιοποίησης των προσφερόμενων ειδών τροφής (τροχόζωα, Artemia και βιομηχανική τροφή).
Β. Βελτιωμένο πρωτόκολλο εκτροφής (δεύτερος χρόνος του έργου). Από τα αποτελέσματα του πρώτου έτους θα φτιαχτεί ένα βελτιωμένο πρωτόκολλο που θα βασίζεται στην ανάλυση των ιστολογικών δεδομένων και θα αφορούν τον συγχρονισμό της ανάπτυξης των βασικών δομών των δυο κύριων συστημάτων του οργανισμού, του πεπτικού συστήματος και του ματιού, με το διατροφικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε. Επίσης, θα αξιολογηθεί η διατροφική προτίμηση σε σχέση με το διατροφικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε και θα προσδιοριστούν και πάλι τυχόν περίοδοι υποσιτισμού και προβληματικής αξιοποίησης των προσφερόμενων ειδών τροφής. Το βελτιωμένο αυτό πρωτόκολλο θα χρησιμοποιηθεί στις εκτροφές του δεύτερου έτους, που θα περιλαμβάνουν και δοκιμές με την χρήση προβιοτικών τόσο στο νερό όσο και στην τροφή (Εργασία 2.3). Όπως και τον πρώτο χρόνο, δείγματα 10 ατόμων θα συλλεχθούν σε τακτά διαστήματα και θα διατηρηθούν σε διάλυμα 4% formaldehyde: 1% gluteraldehyde για εργαστηριακές αναλύσεις. Από τις εκτροφές του δεύτερου έτους θα γίνει αξιολόγησή του βελτιωμένου πρωτοκόλλου και σύγκριση με το αρχικό του πρώτου έτους, αλλά και συγκριτικά με την χρήση ή μη των προβιοτικών.
Γ) Εργαστηριακές μελέτες (δεύτερος και τρίτος χρόνος του έργου). Η μελέτη της οντογένεσης του πεπτικού συστήματος και ματιού θα πραγματοποιηθεί με χρήση μικροσκοπίου και στερεοσκοπίου, όπου στις ιστολογικές τομές νυμφών θα εντοπιστεί η κάθε δομή του αντίστοιχου συστήματος. Η μελέτη της οντογένεσης του πεπτικού συστήματος και ματιού αποσκοπεί στην χρονική χαρτογράφηση της εμφάνισης των δομών που αποτελούν κάθε σύστημα.
Για τον υπολογισμό του ποσοστού κάλυψης ιστολογικών τομών συκωτιού με λίπος θα φωτογραφηθούν κάτω από μικροσκόπιο διαφορετικές περιοχές του συκωτιού, που θα επιλεχθούν τυχαία από αντίστοιχες διαφορετικές τομές της ίδιας νύμφης. Η μεθοδολογία ανάλυσης των φωτογραφιών αποσκοπεί στον εντοπισμό των περιόδων διατροφικής ευρωστίας ή καταπόνησης του οργανισμού από την αντίστοιχη διατήρηση σε ικανοποιητικά ποσοστά ή σημαντικής μείωσης του ποσοστού λίπους στο συκώτι των νυμφών (Papadakis et al., 2013; Papadakis et al., 2009). Για τη μελέτη του στομαχικού περιεχόμενου και της διατροφικής προτίμησης θα φωτογραφηθούν αντιπροσωπευτικές τομές ιχθυονυμφών στις ημέρες δειγματοληψίας. Στην συνέχεια, με την χρήση μικροσκοπίου και συστήματος ανάλυσης εικόνα θα προσδιοριστεί ο τύπος της τροφής που υπήρχε μέσα στο στομάχι, ώστε να περιγραφεί η διατροφική προτίμηση του είδους σε σχέση με την σύσταση του πρωτοκόλλου που υπήρχε την δεδομένη στιγμή. Δεδομένα που θα ληφθούν από το πρόγραμμα της ανάλυσης της εικόνας φωτογραφιών από ιστολογικές τομές του αμφιβληστροειδή καθώς και του φακού του ματιού θα χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της οπτικής ικανότητας των νυμφών του μαγιάτικου (Neave, 1984). Βάση αυτών των αποτελεσμάτων θα εκτιμηθεί και η απόσταση αντίληψης αντικειμένων συγκεκριμένου μεγέθους όπως θα μπορούσε να είναι το μέγεθος των τροχοζώων ή των ναυπλίων της Artemia, ώστε να αξιολογηθεί η καταλληλότητα της ποσότητας της τροφής που παρέχεται.
Εργασία 2.3 Χρήση προβιοτικών στην νυμφική εκτροφή (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Δυο πειράματα σχετικά με τα προβιοτικά θα πραγματοποιηθούν στο εκκολαπτήριο της ΓΑΛΑΞΙΔΙ. Στο πρώτο πείραμα στην ομάδα των προβιοτικών (δυο δεξαμενές των 4 κυβικών μέτρων) θα τοποθετηθούν βιολογικά φίλτρα 20 λίτρων που θα έχουν ειδικό κεραμικό υλικό (Fluval, Biomax) εμποτισμένο σε καλλιέργειεςPhaeobactersp. Θα γίνει εκτροφή των ιχθυονυμφών και δειγματοληψίες για τη μελέτη της μικροχλωρίδας του νερού, της ζωντανής τροφής και της εντερικής μικροχλωρίδας των ιχθυονυμφών για να ποσοτικοποιηθεί η παρουσία του προβιοτικού στο νερό και τη ζωντανή τροφή (δεν αποικίζει τις νύμφες), καθώς και την επίδραση του στη καλλιεργήσιμη και μη καλλιεργήσιμη μικροχλωρίδα του εντερικού σωλήνα. Στο τέλος της νυμφικής εκτροφής θα γίνει μια αξιολόγηση και εάν η επίδραση των βιολογικών φίλτρων κριθεί θετικά αυτά θα χρησιμοποιηθούν και στο επόμενο πείραμα.
Στο δεύτερο πείραμα θα χρησιμοποιηθούν βακτήρια τα οποία θα προστίθενται στη δεξαμενή εμπλουτισμού των τροχοζώων (ή της Artemia) για μισή ώρα πριν τη συγκομιδή τους και πριν το πλύσιμο και τάισμα στις δεξαμενές εκτροφής. Τα τροχόζωα και η Artemia έχουν την ικανότητα να βιο-εγκλείουν τα προβιοτικά βακτήρια και έτσι να μεταφέρουν κάποια προβιοτικά. Έτσι τα προβιοτικά εγκαθίστανται με έναν σχετικά απλό τρόπο στο πεπτικό σωλήνα και μπορούν να έχουν ένα θετικό αποτέλεσμα για τις ιχθυονύμφες. Οι δειγματοληψίες θα είναι παρόμοιες με το πρώτο πείραμα. Και στα δυο πειράματα θα μετρηθούν και ζωοτεχνικές παράμετροι όπως ανάπτυξη και επιβίωση. Θα γίνει επίσης ποσοτικοποίηση των προβιοτικών στις ιχθυονύμφες, στο νερό και στη ζωντανή τροφή.
Εργασία 2.4 Περιγραφή του μικροβιώματος και μελέτη των πρωτεϊνών μελών των οικογενειών των HSPsκαι MAPKsτων νυμφών (ΤΓΙΥΠ, ΑΠΘ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Ο πειραματικός σχεδιασμός θα περιλαμβάνει μελέτη δειγμάτων μεσεντέρων κατά τη νυμφική εκτροφή σε σχέση με τη διατροφή τους. Τα δείγματα με βάρος ιστού 0.5 g σε τρεις επαναλήψεις θα παρθούν ανα διαφορετική ημέρα εκτροφής την ημέρα 0 (εκκόλαψη), την ημέρα 3 (διατροφή με ρότιφερ), την ημέρα 18 (διατροφή με Artemia), την ημέρα 20 (διατροφή με σύμπηκτο), την ημέρα 34 (στάδιο νεαρού ιχθυδίου) και όταν θα είναι ιχθύδιο βάρους 1 g. O ιστός αυτός για τη μελέτη του μικροβιώματος (0.3 g) θα υπόκειται σε πλύση με απιονισμένο και αποστειρωμένο νερό και αποθήκευση των δειγμάτων σε υπερκατάψυξη (-80oC) μέχρι την εκχύλιση του DNA όπως σε προηγούμενες μελέτες (π.χ., Kormas et al., 2014; Mente et al., 2016). H προκαρυωτική ποικιλότητα του εντέρου θα προσδιοριστεί μέσω της ποικιλότητας του 16S rRNA γονιδίου (περιοχή V3-V4) μέσω αλληλούχισης επόμενης γενιάς (πλατφόρμα Illumina) και με τη χρήση εκκινητών ειδικών για τα Bacteria (βλ. Kormas et al. 2014; Mente et al. 2016). Για την μελέτη των πρωτεϊνών HSPsκαι MAPKsτων νυμφών θα χρησιμοποιηθούν 0.2 gαπό τα 0.5 g. Τα δείγματα θα καταψύχονται άμεσα σε υγρό άζωτο ή ξηρό πάγο. Ακολουθεί αποθήκευση σε υπερκατάψυξη (-80oC) μέχρι την εκχύλιση των πρωτεϊνών και ανοσοαποτύπωση κατά Westernblotόπως περιγράφεται σε προηγούμενες εργασίες (π.χ. Antonopoulouetal., 2013, 2014, 2017).
Τα δεδομένα που θα προκύψουν θα αναλυθούν ώστε να γίνει περιγραφή των μικροοργανισμών και εμπλοκή τους σε μεταβολικά μονοπάτια φυσιολογίας θρέψης. Η χρονική μεταβολή των εντερικών μικροβιοκοινοτήτων και η ημιποσοτική μέθοδος ανοσοανίχνευσης των πρωτεϊνικών δεικτών HSPsκαι MAPKs θα καταδείξει ποια βακτηριακά είδη έχουν μεγαλύτερη οικοφυσιολογική σημασία για τα νυμφικά στάδια (core microbiota). Επίσης ποια βακτηριακά είδη είναι ειδικά στα διάφορα στάδια και τη συσχέτισή τους με τις εξεταζόμενες πρωτεϊνες, ώστε να χρησιμοποιηθούν μελλοντικά τα βακτηριακά είδη στη διατροφή των ψαριών για την καλύτερη αφομοίωση των θρεπτικών συστατικών της ιχθυοτροφής. Βάσει των βακτηριακών ειδών και της φυσιολογικής απόκρισης που απαντώνται στο έντερο, θα διερευνηθούν, από βάσεις γονιδιωματικών δεδομένων μικροοργανισμών (in silico).
Εργασία 2.5 Περιγραφή της ανάπτυξης του σκελετού και των μορφοανατομικών παραμορφώσεων σε σχέση με το πρωτόκολλο εκτροφής (ΠΠ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Η επιτυχής υλοποίησης της ενότητας εργασίας αυτής βασίζεται στη σωστή δειγματοληψία των νυμφών:
Μελέτη ανάπτυξης του σκελετού. Από την εκκόλαψη των αυγών και καθ’ όλη τη διάρκεια της νυμφικής εκτροφής θα λαμβάνονται δείγματα περίπου 20 ατόμων κάθε 4 ημέρες. Τα άτομα θα συντηρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5% και θα αποθηκεύονται στο σκοτάδι. Η επεξεργασία των δειγμάτων αυτών θα γίνει μέσω διπλής χρώσης με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας ούτως ώστε να γίνει εφικτή η παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Θα πραγματοποιηθεί η μελέτη της οντογένεσης του σκελετού σε έναν πληθυσμό από κάθε μια από τις συνθήκες εκτροφής που θα πραγματοποιηθούν (κοινό πρωτόκολλο, χρήση προβιοτικών) και θα καταγραφεί τυχόν διαφοροποίηση στην ταχύτητα ανάπτυξης αυτού και στην τελική του εικόνα (μεριστικά).
Μελέτη παραμορφώσεων. Η εμφάνιση ή όχι παραμορφώσεων στους εκτρεφόμενους υπό διαφορετικές συνθήκες πληθυσμούς θα μελετηθεί σε δείγματα (100 ατόμων ανά μέθοδο εκτροφής ανά επανάληψη) που θα ληφθούν τυχαία α) στο στάδιο της κάμψης της νωτοχορδής (8-10 mm Ολικό Μήκος, ΟΜ) και β) στο τέλος της παραμόρφωσης (18-20 mm OM) και θα συντηρηθούν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5%. Για τη μελέτη των σκελετικών παραμορφώσεων θα ακολουθήσει διπλή χρώση των νυμφικών δειγμάτων με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας και παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί δειγματοληψία και σε ένα 3οστάδιο (ιχθύδια, >30mmTL) όπου η μελέτη του σκελετού των ψαριών θα γίνει με ακτινογραφίες (καθώς η χρώση σε τόσο μεγάλα δείγματα δεν αποδίδει). Πρέπει να τονιστεί ότι χρησιμοποιώντας τα δείγματα της προηγούμενης μελέτης (ανάπτυξη σκελετού), θα είναι εφικτή η ανάδρομη προσέγγιση του σταδίου όπου οι σκελετικές παραμορφώσεις. Επίσης, χρησιμοποιώντας τα δείγματα της προηγούμενης μελέτης, θα είναι εφικτή η ανάδρομη μελέτη του σταδίου όπου οι σκελετικές παραμορφώσεις αναπτύσσονται.
Εργασία 2.6 Διάχυση αποτελεσμάτων νυμφικών εκτροφών και παραγωγής γόνου (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΠΠ, ΤΓΙΥΠ, ΑΠΘ)
Με βάση τα αποτελέσματα της ΕΕ 2 στο τέλος κάθε έτους, θα αξιολογούνται οι δράσεις διάχυσης αποτελεσμάτων, με την συγγραφή, σε πρώτη φάση, εκλαϊκευμένων άρθρων σε επαγγελματικά περιοδικά του τομέα, την παρουσίαση αποτελεσμάτων σε διεθνή και εθνικά συνέδρια και την ετοιμασία δημοσιεύσεων σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά.
