ΕΕ1 Διαχείριση γεννητόρων και αναπαραγωγή
Περιγραφή Ενότητας Εργασίας
Το πρώτο στάδιο στην βιομηχανική παραγωγή ενός οργανισμού είναι ο έλεγχος της αναπαραγωγής του και η παραγωγή άριστης ποιότητας αυγών. Στην ΕΕ1 Διαχείριση γεννητόρων και αναπαραγωγή θα γίνει παραγωγή εξειδικευμένης τροφής γεννητόρων μαγιάτικου και σύγκριση με τις υφιστάμενες τροφές, οι οποίες απευθύνονται σε άλλα είδη ψαριών. Στην συνέχεια θα γίνει προσδιορισμός της συμμετοχής των γεννητόρων στην αναπαραγωγική διαδικασία. Αυτή η εργασία θα μας δείξει εάν η γονική συμμετοχή στον αριθμό των απογόνων μιας δεξαμενής είναι ομοιόμορφη. Εάν δεν συμβαίνει αυτό, με την πάροδο του χρόνου θα μειωθεί η γενετική παραλλακτικότητα και η ετεροζυγωτία του παραγόμενου πληθυσμού, και ίσως και οι παραγωγικοί δείκτες του. Για να μάθουμε εάν μπορούμε να βασιστούμε σε ομαδικές γέννες για την παραγωγή πολλών οικογενειών, θα αναλύσουμε γενετικά και θα προσδιορίσουμε την πατρότητα στους απογόνους που θα παραχθούν από όλη την αναπαραγωγική περίοδο μιας ομάδας γεννητόρων. Σαν μέθοδος αντιμετώπισης του πιθανού προβλήματος περιορισμένης γονικής συμμετοχή των γεννητόρων, θα γίνει αξιολόγηση της δυνατότητας του μαγιάτικου για αναπαραγωγή μεμονωμένων ζευγών γεννητόρων σε ξεχωριστές δεξαμενές, με στόχο την ανάπτυξη μεθόδων επιλογής γεννητόρων για προγράμματα γενετικής βελτίωσης. Με στόχο την βελτίωση της αναπαραγωγής του μαγιάτικου, θα αξιολογηθεί η χρήση ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) για την προαγωγή της γαμετογένεσης σε ψάρια που διατηρούνται σε δεξαμενές, όπου έχει δειχθεί ότι αποτυγχάνουν να αναπαραχθούν. Επίσης, θα γίνει βελτίωση της σπερμίασης των αρσενικών με χρήση αναπαραγωγικών ορμονών, για την βελτίωση της γονιμοποίησης των αυγών. Τέλος, με στόχο την συλλογή στοιχείων για τον καλύτερο προγραμματισμό της παραγωγής αυγών, θα αξιολογηθούν τυχόν αλλαγές στην ποιότητα των αυγών κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου, αλλά και σε σχέση με την διατροφή των γεννητόρων.
Εργασίες και Παραδοτέα
Εργασία 1.1 Παραγωγή εξειδικευμένης τροφής γεννητόρων (ΙΡΙΔΑ, ΙΘΑΒΒΥΚ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 1.1.1. Αξιολόγηση νέας εξειδικευμένης βιομηχανικής τροφής (Μ24)
Εργασία 1.2 Αναπαραγωγή μεμονωμένων ζευγών σε σχέση με ομάδες γεννητόρων (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παραδοτέο 1.2.1. Αξιολόγηση μεθόδου αναπαραγωγής μεμονωμένων ζευγαριών (Μ34)
Εργασία 1.3 Γενετικός προσδιορισμός της συμμετοχής των γεννητόρων στην αναπαραγωγική διαδικασία (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παραδοτέο 1.3.1. Ταυτοποίηση γεννητόρων (Μ06)
Παραδοτέο 1.3.2. Γενετική ανάλυση αυγών και προσδιορισμός της σχετικής συμμετοχής των γεννητόρων (Μ14)
Εργασία 1.4 Χρήση ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης για την προαγωγή της γαμετογένεσης σε μαγιάτικα που διατηρούνται σε δεξαμενές (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Παραδοτέο 1.4.1. Επίδραση της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης στη γαμετογένεση (Μ24)
Εργασία 1.5 Βελτίωση σπερμίασης αρσενικών για την βελτίωση του ποσοστού γονιμοποίησης των παραγομένων αυγών (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παραδοτέο 1.5.1. Επίδραση διαφορετικών ορμονών στην ποιότητα σπέρματος και συσχετισμός με τις αναπαραγωγικές ορμόνες στο αίμα (Μ17)
Εργασία 1.6 Αλλαγές στην σύσταση και ποιότητα αυγών σε σχέση με την διατροφή των γεννητόρων (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 1.6.1. Επίδραση της διατροφής γεννητόρων μαγιάτικου στην σύσταση και ποιότητα των αυγών (Μ24)
Παραδοτέο 1.6.2. Αξιολόγηση της σύσταση και ποιότητας των αυγών κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου (Μ34)
Εργασία 1.7 Διάχυση αποτελεσμάτων διαχείρισης γεννητόρων και αναπαραγωγής (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Παραδοτέο 1.7.1. Εκλαϊκευμένα άρθρα αποτελεσμάτων διαχείρισης γεννητόρων και αναπαραγωγής (Μ24)
Παραδοτέο 1.1.1. Αξιολόγηση νέας εξειδικευμένης βιομηχανικής τροφής (Μ24)
Εργασία 1.2 Αναπαραγωγή μεμονωμένων ζευγών σε σχέση με ομάδες γεννητόρων (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παραδοτέο 1.2.1. Αξιολόγηση μεθόδου αναπαραγωγής μεμονωμένων ζευγαριών (Μ34)
Εργασία 1.3 Γενετικός προσδιορισμός της συμμετοχής των γεννητόρων στην αναπαραγωγική διαδικασία (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παραδοτέο 1.3.1. Ταυτοποίηση γεννητόρων (Μ06)
Παραδοτέο 1.3.2. Γενετική ανάλυση αυγών και προσδιορισμός της σχετικής συμμετοχής των γεννητόρων (Μ14)
Εργασία 1.4 Χρήση ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης για την προαγωγή της γαμετογένεσης σε μαγιάτικα που διατηρούνται σε δεξαμενές (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Παραδοτέο 1.4.1. Επίδραση της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης στη γαμετογένεση (Μ24)
Εργασία 1.5 Βελτίωση σπερμίασης αρσενικών για την βελτίωση του ποσοστού γονιμοποίησης των παραγομένων αυγών (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παραδοτέο 1.5.1. Επίδραση διαφορετικών ορμονών στην ποιότητα σπέρματος και συσχετισμός με τις αναπαραγωγικές ορμόνες στο αίμα (Μ17)
Εργασία 1.6 Αλλαγές στην σύσταση και ποιότητα αυγών σε σχέση με την διατροφή των γεννητόρων (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Παραδοτέο 1.6.1. Επίδραση της διατροφής γεννητόρων μαγιάτικου στην σύσταση και ποιότητα των αυγών (Μ24)
Παραδοτέο 1.6.2. Αξιολόγηση της σύσταση και ποιότητας των αυγών κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου (Μ34)
Εργασία 1.7 Διάχυση αποτελεσμάτων διαχείρισης γεννητόρων και αναπαραγωγής (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Παραδοτέο 1.7.1. Εκλαϊκευμένα άρθρα αποτελεσμάτων διαχείρισης γεννητόρων και αναπαραγωγής (Μ24)
Αναλυτική περιγραφή εργασιών
Εργασία 1.1 Παραγωγή εξειδικευμένης τροφής γεννητόρων μαγιάτικου και σύγκριση με τις υφιστάμενες τροφές γεννητόρων, οι οποίες απευθύνονται κυρίως σε άλλα είδη ψαριών με μικρότερους ρυθμούς αύξησης (ΙΡΙΔΑ, ΙΘΑΒΒΥΚ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Θα παραχθεί εξειδικευμένη τροφή για γεννήτορες μαγιάτικου, με βάση την πρόσφατα αποκτηθείσα γνώση από το Ευρωπαϊκό πρόγραμμα DIVERSIFY, στο οποίο συμμετείχαν αρκετοί εταίροι από την παρούσα πρόταση αλλά και στις πληροφορίες που παρέχει η διεθνής βιβλιογραφία (Rodríguez-Barreto et al., 2014; Migaudetal., 2013; Watanabe and Vassallo-Agius, 2003). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη της τροφής θα είναι υψηλή ανερχόμενη στο 52%, και θα παρέχεται από ιχθυάλευρο χωρίς την προσθήκη πρωτεϊνών φυτικής προέλευσης. Θα προστεθούν συμπληρώματα τρυπτοφάνης για επαγωγή της ωρίμανσης(Akiyama et al., 1996)και ταυρίνης για τη βελτίωση της γονιμότητας (Matsunari et al., 2006). Λόγω της γρήγορης αύξησης του μαγιάτικου οι απαιτήσεις σε ολικά λίπη και πολυακόρεστα (DHA, EPA, ARA) λιπαρά οξέα είναι αυξημένες. Για το λόγο αυτό η περιεκτικότητα της τροφής σε λίπος θα είναι στο 20% και θα χρησιμοποιηθεί λάδι πλούσιο σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (πχ λάδι τόνου)(Bruce et al., 1999) τα οποία περιέχονται στη σωστή αναλογία για την αποφυγή ανταγωνισμού κατά τη σύνθεση των εικοσανοειδών. Για την αποφυγή της συσσώρευσης του λινολεϊκού οξέος 18:2 ω-6 δεν θα χρησιμοποιηθούν λίπη φυτικής προέλευσης. Η ποσότητα ω-3 λιπαρών οξέων στην τροφή θα είναι 1,5 και 2,5% της τροφής η οποία είναι αρκετά υψηλότερη από αυτή που απαιτείται για να νεαρά άτομα (Watanabe et al., 1984). Η τροφή θα περιέχει συμπληρώματα βιταμινών A (2500 IU/Kg), C (50 mg/kg), D (2500 IU/Kg), E (100 IU/kg) λόγω των αυξημένων αναγκών των ψαριών για βιταμίνες κατά την αναπαραγωγή και των σημαντικών δράσεων που έχουν οι βιταμίνες στο μεταβολισμό. Στην τροφή θα προστεθούν μικροθρεπικά στοιχεία όπως καροτενοειδή (30 ppm) (Vassallo-Agius et al., 2001) και νουκλεοτίδια (0.2-0.3%) (González-Vecino et al. 2004) για την ευεργετική τους δράση στην παραγωγή αυγών. H προέλευση αυτών των συστατικών θα προέρχεται από την προσθήκη, κριλ, καλαμαράλευρου και λεκιθίνης (Watanabe et al., 1985).
Η νέα τροφή (ΙΡΙΔΑ) θα συγκριθεί με την εμπορική τροφή για γεννήτορες Μεσογειακών ειδών (VITALIS), χρησιμοποιώντας γεννήτορες μαγιάτικου μέσου βάρους 15 kg που έχουν ήδη ολοκληρώσει την αναπαραγωγική τους ωρίμανση και έχουν αναπαραχθεί επιτυχώς περισσότερες από 3 αναπαραγωγικές περιόδους. Επίσης, οι γεννήτορες που θα χρησιμοποιηθούν έχουν ήδη εγκλιματιστεί στην χορήγηση εμπορικής τροφής γεννητόρων, η ίδια που θα χρησιμοποιηθεί και για την σύγκριση των δύο τροφών. Θα χρησιμοποιηθούν δυο ομάδες ψαριών, οι οποίες θα λάβουν τις δύο τροφές για όλη την διάρκεια του έτους, για περίοδο 2 ετών (και δυο αναπαραγωγικών περιόδων). Η τροφή θα χορηγείται μέχρι κορεσμού τρείς φορές την βδομάδα. Θα καταγράφονται η δεκτικότητα της τροφής και η κατανάλωσή της, και κατά την ωοτοκία θα γίνουν μετρήσεις ποιότητας και ποσότητας των αυγών (γονιμότητα, ποσοστό γονιμοποίησης, ποσοστό επιβίωσης εμβρύων, εκκόλαψη, επιβίωση νυμφών). Η τροφή που θα παραχθεί θα έχει χαρακτηριστικά εμπορικής τροφής, δηλαδή προϊόντος με όλα τα απαιτούμενα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά (πλευστότητα, ταχύτητα βύθισης, σχετική υγρασία, διάμετρος κόκκου, κτλ.) που θα μπορούσε άμεσα να υποστηρίξει την βελτίωση της αναπαραγωγικής επιτυχίας του μαγιάτικου. Σε αυτή την περίπτωση, θα μπορούσε να αποτελέσει άμεσα εμπορικό προϊόν προς εκμετάλλευση τόσο από τις εταιρείες παραγωγής ιχθυοτροφιών, όσο και από τις εταιρείες παραγωγής που προσπαθούν να αναπτύξουν την παραγωγή μαγιάτικου σε βιομηχανική κλίμακα.
Εργασία 1.2 Αναπαραγωγή μεμονωμένων ζευγών γεννητόρων σε σχέση με ομάδες γεννητόρων, με στόχο την ανάπτυξη μεθόδων επιλογής γεννητόρων για προγράμματα γενετικής βελτίωσης (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Η τεχνητή γονιμοποίηση είναι μία τεχνική επιλεκτικής αναπαραγωγής η οποία χρησιμοποιείται εκτεταμένα σε προγράμματα γενετικής βελτίωσης ψαριών. Ωστόσο, το μαγιάτικο είναι ένα ψάρι που φέρει ισχυρά μυϊκά τοιχώματα στην κοιλιακή χώρα, επομένως δεν είναι δυνατή η συλλογή γαμετών για τεχνητή γονιμοποίηση. Ένας τρόπος για να υπερκεραστεί το συγκεκριμένο πρόβλημα είναι η χρήση ζευγών γεννητόρων, δηλαδή επιλεγμένοι γεννήτορες που μπορούν να γεννήσουν ελεύθερα μετά από ορμονική διαχείριση, οι οποίοι διατηρούνται σε μία δεξαμενή. Στο πρόγραμμα ΜΑΓΙΑΤΙΚΟ θα χρησιμοποιηθούν γεννήτορες που διατηρούνται στις εγκαταστάσεις της εταιρείας ΑΡΓΟ σε ιχθυοκλωβούς, μέσου βάρους 15 kg, οι οποίοι είναι αναπαραγωγικά ώριμοι. Η συγκεκριμένη εταιρεία διαθέτει χερσαίες δεξαμενές όγκου 25 m3στις οποίες θα μεταφερθούν τα ζεύγη γεννητόρων μαγιάτικου κατά την αναπαραγωγική περίοδο. Στα ψάρια θα χορηγηθούν εμφυτεύματα GnRHa μετά από αξιολόγηση της αναπαραγωγικής τους κατάστασης. Σε 24ωρη βάση θα γίνεται παρακολούθηση των ωοτοκιών των ψαριών, παράλληλα με την αξιολόγηση ποσοτικών και ποιοτικών παραμέτρων των αυγών, όπως γονιμότητα, γονιμοποίηση, επιβίωση εμβρύων, εκκόλαψη και επιβίωση νυμφών μέχρι την απορρόφηση της λεκίθου (Panini et al., 2001).
Εργασία 1.3 Γενετική ταυτοποίηση και προσδιορισμός της συμμετοχής των γεννητόρων στην αναπαραγωγική διαδικασία μετά από ορμονική θεραπεία με ενέσεις ή εμφυτεύματα GnRHa (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Σε πρώτο στάδιο, με την χρήση μικροδορυφορικών γενετικών δεικτών και αλληλουχιών της περιοχής ελέγχου Dloop του μιτοχονδριακού DNA, θα πραγματοποιηθεί η γενετική ταυτοποίηση των γεννητόρων από τις συνεργαζόμενες εταιρίες που θα συμμετέχουν στα πειράματα αναπαραγωγής και θα γίνει η κατάταξη των ατόμων σε μια από τις δύο ομάδες απλοτύπων (haplogroups) που έχουν περιγραφεί στο μαγιάτικο στην Μεσόγειο και τον Ανατολικό Ατλαντικό. Η ίδια διαδικασία με την χρήση μόνο μικροδορυφορικών θα ακολουθηθεί και για τα αυγά που θα προκύψουν από όλες τις γέννες σε μια σειρά πειραμάτων. Δεν απαιτείται η ταυτόχρονη χρήση του μιτοχονδριακού δείκτη επειδή μετά τον προσδιορισμό πατρότητας σε αυγά και γνωρίζοντας τον θηλυκό γεννήτορα θα ξέρουμε αυτόματα και σε ποιο απλότυπο θα ανήκει και το άτομο. Αυτό θα γίνει με σκοπό να προσδιορίσουμε την σχετική συμμετοχή του κάθε γεννήτορα στην αναπαραγωγική διαδικασία, να εντοπίσουμε λιγότερο και περισσότερο επιτυχείς διασταυρώσεις και να καταγράψουμε αν οι αποδόσεις αυτές σχετίζονται με το γενετικό υπόβαθρο των γεννητόρων.
Εργασία 1.4 Χρήση ανασυνδυασμένης ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) για την προαγωγή της γαμετογένεσης σε μαγιάτικα που διατηρούνται σε δεξαμενές (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Μέχρι τώρα, γεννήτορες που διατηρούνται σε δεξαμενές που τροφοδοτούνται με το τυπικό νερό γεώτρησης που χρησιμοποιούν όλοι γενικά οι ιχθυογεννητικοί σταθμοί (για λόγους βιοασφάλειας) δεν ολοκληρώνουν την διαδικασία της γαμετογένεσης, με αποτέλεσμα να μήν μπορεί να γίνει χρήση των μεθόδων πρόκλησης ωοτοκίας. Στην εργασία αυτή, θα χρησιμοποιηθούν αναπαραγωγικά ώριμοι γεννήτορες που διατηρούνται σε χερσαίες εγκαταστάσεις, και στα μέσα στάδια της γαμετογένεσης θα γίνει χορήγηση ενέσιμου διαλύματος ανασυνδυασμένης FSH τόσο σε θηλυκά, όσο και σε αρσενικά άτομα. Παράλληλα, θα διατηρηθεί και ένας πληθυσμός γεννητόρων ως μάρτυρας του πειράματος, σε ίδιες περιβαλλοντικές συνθήκες (φωτοπεριόδου και θερμοπεριόδου). Κατά την έναρξη της αναμενόμενης αναπαραγωγικής περιόδου (Ιούνιος), θα γίνει συγκριτική αξιολόγηση της αναπαραγωγικής κατάστασης των δύο ομάδων γεννητόρων, τόσο όσον αφορά τα θηλυκά άτομα (λήψη βιοψίας ωοθηκών, διάμετρος και κατάσταση ωοκυττάρων) αλλά και τα αρσενικά άτομα (λήψη σπέρματος και αξιολόγηση ποιότητας). Εάν τα ψάρια έχουν ολοκληρώσει την γαμετογένεσή τους, θα τους χορηγηθούν εμφυτεύματα GnRHa για την πρόκληση ωοτοκίας και βελτίωση της σπερμίασης των γεννητόρων, ενώ θα τοποθετηθούν παθητικοί συλλέκτες αυγών. Θα γίνει αξιολόγηση της ποιότητας και ποσότητας των αυγών (γονιμότητα, ποσοστό γονιμοποίησης, επιβίωση εμβρύων, ποσοστό εκκόλαψης, επιβίωση νυμφών) συγκριτικά μεταξύ των δύο διαφορετικών πρωτοκόλλων.
Εργασία 1.5 Βελτίωση σπερμίασης αρσενικών με χρήση διαφορετικών ορμονών, για την βελτίωση του ποσοστού γονιμοποίησης των παραγομένων αυγών (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παρά το γεγονός ότι έχουμε επιτύχει την αναπαραγωγή του μαγιάτικου σε συνθήκες εκτροφής, εν τούτης η παραγωγή σπέρματος ακόμα και σε γεννήτορες που διατηρούνται σε ιχθυοκλωβούς είναι μειωμένη σε σχέση με άγριους γεννήτορες. Αυτό ίσως να είναι ένας λόγος για το σχετικά μειωμένο ποσοστό γονιμοποίησης που παρατηρείται στο μαγιάτικο. Στην εργασίας αυτή θα χρησιμοποιηθούν ώριμοι αρσενικοί γεννήτορες μαγιάτικου, οι οποίοι διατηρούνται σε χερσαίες εγκαταστάσεις. Κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου θα γίνει χορήγηση είτε εμφυτευμάτων GnRHa είτε ενέσιμης χοριονικής γοναδοτροπίνης (hCG) σε αρσενικά άτομα. Ο πληθυσμός θα αξιολογηθεί στις ημέρες 0, 3, 7, και 14, όσον αφορά την ποιότητα σπέρματος με τη χρήση αυτοματοποιημένου συστήματος ανάλυσης σπέρματος (Computer Assisted Sperm Analysis). Παράλληλα, θα γίνει αξιολόγηση των επιπέδων φυλετικών στεροειδών (Τ, 11-ΚΤ, 17,20-β-DHP) στο αίμα των ψαριών που θα λαμβάνεται τις αντίστοιχες ημέρες μετά την ορμονική διαχείριση.
Εργασία 1.6 Αλλαγές στην σύσταση και ποιότητα αυγών κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου μετά από θεραπεία με ενέσεις και εμφυτεύματα GnRHa, και σε σχέση με την διατροφή των γεννητόρων (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Το μαγιάτικο γεννά πολλαπλές φορές κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου και μετά από πρόκληση με GnRHa. Είναι χρήσιμο να αξιολογήσουμε την ποιότητα των παραγομένων αυγών σε σχέση με την σύσταση τους, ειδικά αφού το ψάρια συνήθως δεν τρέφονται κατά την διάρκεια της παραμονής του στις δεξαμενές ωοτοκίας, μετά την μεταφορά του από τους ιχθυοκλωβούς. Έτσι, γεννήτορες που διατηρούνται σε ιχθυοκλωβούς της εταιρείας ΑΡΓΟ καθ’όλη τη διάρκεια του έτους και τρέφονται με διαφορετικές τροφές, θα μεταφερθούν στις χερσαίες εγκαταστάσεις ωοτοκίας της εταιρείας, μετά από έλεγχο της αναπαραγωγικής τους κατάστασης και πρόκληση ωοτοκιας. Θα χρησιμοποιηθεί ίσος αριθμός ατόμων μεταξύ των διαφορετικών θεραπειών σε ίση αναλογία φύλου (1:1). Οι δεξαμενές και στις δύο εγκαταστάσεις θα είναι εφοδιασμένες με συλλέκτες αυγών, οι οποίοι θα ελέγχονται τρεις φορές κάθε μέρα. Όταν εντοπίζονται αυγά, θα συλλέγονται και θα αξιολογούνται για την ποιότητα τους (γονιμότητα, ποσοστό γονιμοποίησης, επιβίωση εμβρύων, εκκόλαψη, επιβίωση νυμφών). Παράλληλα, θα συλλέγεται δείγμα από κάθε διαφορετική ωοτοκία και θα μελετηθούν η ενεργειακή πυκνότητα, η περιεκτικότητα σε λίπη, πρωτεΐνες, υγρασία, τέφρα και λιπαρά οξέα.
Όλες οι αναλύσεις θα γίνουν σύμφωνα με τις προδιαγραφές της AOAC. Οι αναλύσεις θα γίνουν εις διπλούν. Η υγρασία θα προσδιοριστεί ζυγίζοντας μια ποσότητα 2.0 g θα ζυγιστεί με ακρίβεια 0.0001 g και θα τοποθετηθεί τοποθετήθηκε σε ξηραμένη κάψα σε κλίβανο 103±2°C για 16 h. Στη συνέχεια τα δείγματα αυγών θα λυοφιλιοποιηθούν για τις περαιτέρω αναλύσεις. Η τέφρα θα υπολογιστεί μέσω καύσης των αυγών σε κλίβανο στους 600°C για 7 ώρες. Το λίπος θα προσδιοριστεί με τη μέθοδο εκχύλισης που αναπτύχθηκε από τους Folch et al. (1957). Ο προσδιορισμός των λιπαρών οξέων θα βασιστεί στην μετατροπή των λιπαρών οξέων σε μεθυλ-εστέρες λιπαρών οξέων, οι οποίοι είναι πτητικοί και διαχωρίζονται σε αέριο χρωματογράφο. Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου και των πρωτεϊνών θα γίνει με τη μέθοδο Dumas, κατά την οποία 0.1 g δείγματος θα υποβληθεί σε σε καύση εντός θαλάμου υψηλής θερμοκρασίας (περίπου 900°C) παρουσία οξυγόνου. Ο προσδιορισμός της ενέργειας θα γίνει μέσω καύσης των αυγών σε θερμιδόμετρο και η αύξηση της θερμοκρασίας του νερού είναι ανάλογης της ενέργειας που περιέχεται στο δείγμα αυγών.
Εργασία 1.7. Διάχυση αποτελεσμάτων διαχείρισης γεννητόρων και αναπαραγωγής (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Με βάση τα αποτελέσματα της ΕΕ 1 στο τέλος κάθε έτους, θα αξιολογούνται οι δράσεις διάχυσης αποτελεσμάτων, με την συγγραφή, σε πρώτη φάση, εκλαϊκευμένων άρθρων σε επαγγελματικά περιοδικά του τομέα, την παρουσίαση αποτελεσμάτων σε διεθνή και εθνικά συνέδρια και την ετοιμασία δημοσιεύσεων σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά.
Θα παραχθεί εξειδικευμένη τροφή για γεννήτορες μαγιάτικου, με βάση την πρόσφατα αποκτηθείσα γνώση από το Ευρωπαϊκό πρόγραμμα DIVERSIFY, στο οποίο συμμετείχαν αρκετοί εταίροι από την παρούσα πρόταση αλλά και στις πληροφορίες που παρέχει η διεθνής βιβλιογραφία (Rodríguez-Barreto et al., 2014; Migaudetal., 2013; Watanabe and Vassallo-Agius, 2003). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη της τροφής θα είναι υψηλή ανερχόμενη στο 52%, και θα παρέχεται από ιχθυάλευρο χωρίς την προσθήκη πρωτεϊνών φυτικής προέλευσης. Θα προστεθούν συμπληρώματα τρυπτοφάνης για επαγωγή της ωρίμανσης(Akiyama et al., 1996)και ταυρίνης για τη βελτίωση της γονιμότητας (Matsunari et al., 2006). Λόγω της γρήγορης αύξησης του μαγιάτικου οι απαιτήσεις σε ολικά λίπη και πολυακόρεστα (DHA, EPA, ARA) λιπαρά οξέα είναι αυξημένες. Για το λόγο αυτό η περιεκτικότητα της τροφής σε λίπος θα είναι στο 20% και θα χρησιμοποιηθεί λάδι πλούσιο σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (πχ λάδι τόνου)(Bruce et al., 1999) τα οποία περιέχονται στη σωστή αναλογία για την αποφυγή ανταγωνισμού κατά τη σύνθεση των εικοσανοειδών. Για την αποφυγή της συσσώρευσης του λινολεϊκού οξέος 18:2 ω-6 δεν θα χρησιμοποιηθούν λίπη φυτικής προέλευσης. Η ποσότητα ω-3 λιπαρών οξέων στην τροφή θα είναι 1,5 και 2,5% της τροφής η οποία είναι αρκετά υψηλότερη από αυτή που απαιτείται για να νεαρά άτομα (Watanabe et al., 1984). Η τροφή θα περιέχει συμπληρώματα βιταμινών A (2500 IU/Kg), C (50 mg/kg), D (2500 IU/Kg), E (100 IU/kg) λόγω των αυξημένων αναγκών των ψαριών για βιταμίνες κατά την αναπαραγωγή και των σημαντικών δράσεων που έχουν οι βιταμίνες στο μεταβολισμό. Στην τροφή θα προστεθούν μικροθρεπικά στοιχεία όπως καροτενοειδή (30 ppm) (Vassallo-Agius et al., 2001) και νουκλεοτίδια (0.2-0.3%) (González-Vecino et al. 2004) για την ευεργετική τους δράση στην παραγωγή αυγών. H προέλευση αυτών των συστατικών θα προέρχεται από την προσθήκη, κριλ, καλαμαράλευρου και λεκιθίνης (Watanabe et al., 1985).
Η νέα τροφή (ΙΡΙΔΑ) θα συγκριθεί με την εμπορική τροφή για γεννήτορες Μεσογειακών ειδών (VITALIS), χρησιμοποιώντας γεννήτορες μαγιάτικου μέσου βάρους 15 kg που έχουν ήδη ολοκληρώσει την αναπαραγωγική τους ωρίμανση και έχουν αναπαραχθεί επιτυχώς περισσότερες από 3 αναπαραγωγικές περιόδους. Επίσης, οι γεννήτορες που θα χρησιμοποιηθούν έχουν ήδη εγκλιματιστεί στην χορήγηση εμπορικής τροφής γεννητόρων, η ίδια που θα χρησιμοποιηθεί και για την σύγκριση των δύο τροφών. Θα χρησιμοποιηθούν δυο ομάδες ψαριών, οι οποίες θα λάβουν τις δύο τροφές για όλη την διάρκεια του έτους, για περίοδο 2 ετών (και δυο αναπαραγωγικών περιόδων). Η τροφή θα χορηγείται μέχρι κορεσμού τρείς φορές την βδομάδα. Θα καταγράφονται η δεκτικότητα της τροφής και η κατανάλωσή της, και κατά την ωοτοκία θα γίνουν μετρήσεις ποιότητας και ποσότητας των αυγών (γονιμότητα, ποσοστό γονιμοποίησης, ποσοστό επιβίωσης εμβρύων, εκκόλαψη, επιβίωση νυμφών). Η τροφή που θα παραχθεί θα έχει χαρακτηριστικά εμπορικής τροφής, δηλαδή προϊόντος με όλα τα απαιτούμενα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά (πλευστότητα, ταχύτητα βύθισης, σχετική υγρασία, διάμετρος κόκκου, κτλ.) που θα μπορούσε άμεσα να υποστηρίξει την βελτίωση της αναπαραγωγικής επιτυχίας του μαγιάτικου. Σε αυτή την περίπτωση, θα μπορούσε να αποτελέσει άμεσα εμπορικό προϊόν προς εκμετάλλευση τόσο από τις εταιρείες παραγωγής ιχθυοτροφιών, όσο και από τις εταιρείες παραγωγής που προσπαθούν να αναπτύξουν την παραγωγή μαγιάτικου σε βιομηχανική κλίμακα.
Εργασία 1.2 Αναπαραγωγή μεμονωμένων ζευγών γεννητόρων σε σχέση με ομάδες γεννητόρων, με στόχο την ανάπτυξη μεθόδων επιλογής γεννητόρων για προγράμματα γενετικής βελτίωσης (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Η τεχνητή γονιμοποίηση είναι μία τεχνική επιλεκτικής αναπαραγωγής η οποία χρησιμοποιείται εκτεταμένα σε προγράμματα γενετικής βελτίωσης ψαριών. Ωστόσο, το μαγιάτικο είναι ένα ψάρι που φέρει ισχυρά μυϊκά τοιχώματα στην κοιλιακή χώρα, επομένως δεν είναι δυνατή η συλλογή γαμετών για τεχνητή γονιμοποίηση. Ένας τρόπος για να υπερκεραστεί το συγκεκριμένο πρόβλημα είναι η χρήση ζευγών γεννητόρων, δηλαδή επιλεγμένοι γεννήτορες που μπορούν να γεννήσουν ελεύθερα μετά από ορμονική διαχείριση, οι οποίοι διατηρούνται σε μία δεξαμενή. Στο πρόγραμμα ΜΑΓΙΑΤΙΚΟ θα χρησιμοποιηθούν γεννήτορες που διατηρούνται στις εγκαταστάσεις της εταιρείας ΑΡΓΟ σε ιχθυοκλωβούς, μέσου βάρους 15 kg, οι οποίοι είναι αναπαραγωγικά ώριμοι. Η συγκεκριμένη εταιρεία διαθέτει χερσαίες δεξαμενές όγκου 25 m3στις οποίες θα μεταφερθούν τα ζεύγη γεννητόρων μαγιάτικου κατά την αναπαραγωγική περίοδο. Στα ψάρια θα χορηγηθούν εμφυτεύματα GnRHa μετά από αξιολόγηση της αναπαραγωγικής τους κατάστασης. Σε 24ωρη βάση θα γίνεται παρακολούθηση των ωοτοκιών των ψαριών, παράλληλα με την αξιολόγηση ποσοτικών και ποιοτικών παραμέτρων των αυγών, όπως γονιμότητα, γονιμοποίηση, επιβίωση εμβρύων, εκκόλαψη και επιβίωση νυμφών μέχρι την απορρόφηση της λεκίθου (Panini et al., 2001).
Εργασία 1.3 Γενετική ταυτοποίηση και προσδιορισμός της συμμετοχής των γεννητόρων στην αναπαραγωγική διαδικασία μετά από ορμονική θεραπεία με ενέσεις ή εμφυτεύματα GnRHa (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Σε πρώτο στάδιο, με την χρήση μικροδορυφορικών γενετικών δεικτών και αλληλουχιών της περιοχής ελέγχου Dloop του μιτοχονδριακού DNA, θα πραγματοποιηθεί η γενετική ταυτοποίηση των γεννητόρων από τις συνεργαζόμενες εταιρίες που θα συμμετέχουν στα πειράματα αναπαραγωγής και θα γίνει η κατάταξη των ατόμων σε μια από τις δύο ομάδες απλοτύπων (haplogroups) που έχουν περιγραφεί στο μαγιάτικο στην Μεσόγειο και τον Ανατολικό Ατλαντικό. Η ίδια διαδικασία με την χρήση μόνο μικροδορυφορικών θα ακολουθηθεί και για τα αυγά που θα προκύψουν από όλες τις γέννες σε μια σειρά πειραμάτων. Δεν απαιτείται η ταυτόχρονη χρήση του μιτοχονδριακού δείκτη επειδή μετά τον προσδιορισμό πατρότητας σε αυγά και γνωρίζοντας τον θηλυκό γεννήτορα θα ξέρουμε αυτόματα και σε ποιο απλότυπο θα ανήκει και το άτομο. Αυτό θα γίνει με σκοπό να προσδιορίσουμε την σχετική συμμετοχή του κάθε γεννήτορα στην αναπαραγωγική διαδικασία, να εντοπίσουμε λιγότερο και περισσότερο επιτυχείς διασταυρώσεις και να καταγράψουμε αν οι αποδόσεις αυτές σχετίζονται με το γενετικό υπόβαθρο των γεννητόρων.
Εργασία 1.4 Χρήση ανασυνδυασμένης ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) για την προαγωγή της γαμετογένεσης σε μαγιάτικα που διατηρούνται σε δεξαμενές (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Μέχρι τώρα, γεννήτορες που διατηρούνται σε δεξαμενές που τροφοδοτούνται με το τυπικό νερό γεώτρησης που χρησιμοποιούν όλοι γενικά οι ιχθυογεννητικοί σταθμοί (για λόγους βιοασφάλειας) δεν ολοκληρώνουν την διαδικασία της γαμετογένεσης, με αποτέλεσμα να μήν μπορεί να γίνει χρήση των μεθόδων πρόκλησης ωοτοκίας. Στην εργασία αυτή, θα χρησιμοποιηθούν αναπαραγωγικά ώριμοι γεννήτορες που διατηρούνται σε χερσαίες εγκαταστάσεις, και στα μέσα στάδια της γαμετογένεσης θα γίνει χορήγηση ενέσιμου διαλύματος ανασυνδυασμένης FSH τόσο σε θηλυκά, όσο και σε αρσενικά άτομα. Παράλληλα, θα διατηρηθεί και ένας πληθυσμός γεννητόρων ως μάρτυρας του πειράματος, σε ίδιες περιβαλλοντικές συνθήκες (φωτοπεριόδου και θερμοπεριόδου). Κατά την έναρξη της αναμενόμενης αναπαραγωγικής περιόδου (Ιούνιος), θα γίνει συγκριτική αξιολόγηση της αναπαραγωγικής κατάστασης των δύο ομάδων γεννητόρων, τόσο όσον αφορά τα θηλυκά άτομα (λήψη βιοψίας ωοθηκών, διάμετρος και κατάσταση ωοκυττάρων) αλλά και τα αρσενικά άτομα (λήψη σπέρματος και αξιολόγηση ποιότητας). Εάν τα ψάρια έχουν ολοκληρώσει την γαμετογένεσή τους, θα τους χορηγηθούν εμφυτεύματα GnRHa για την πρόκληση ωοτοκίας και βελτίωση της σπερμίασης των γεννητόρων, ενώ θα τοποθετηθούν παθητικοί συλλέκτες αυγών. Θα γίνει αξιολόγηση της ποιότητας και ποσότητας των αυγών (γονιμότητα, ποσοστό γονιμοποίησης, επιβίωση εμβρύων, ποσοστό εκκόλαψης, επιβίωση νυμφών) συγκριτικά μεταξύ των δύο διαφορετικών πρωτοκόλλων.
Εργασία 1.5 Βελτίωση σπερμίασης αρσενικών με χρήση διαφορετικών ορμονών, για την βελτίωση του ποσοστού γονιμοποίησης των παραγομένων αυγών (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ)
Παρά το γεγονός ότι έχουμε επιτύχει την αναπαραγωγή του μαγιάτικου σε συνθήκες εκτροφής, εν τούτης η παραγωγή σπέρματος ακόμα και σε γεννήτορες που διατηρούνται σε ιχθυοκλωβούς είναι μειωμένη σε σχέση με άγριους γεννήτορες. Αυτό ίσως να είναι ένας λόγος για το σχετικά μειωμένο ποσοστό γονιμοποίησης που παρατηρείται στο μαγιάτικο. Στην εργασίας αυτή θα χρησιμοποιηθούν ώριμοι αρσενικοί γεννήτορες μαγιάτικου, οι οποίοι διατηρούνται σε χερσαίες εγκαταστάσεις. Κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου θα γίνει χορήγηση είτε εμφυτευμάτων GnRHa είτε ενέσιμης χοριονικής γοναδοτροπίνης (hCG) σε αρσενικά άτομα. Ο πληθυσμός θα αξιολογηθεί στις ημέρες 0, 3, 7, και 14, όσον αφορά την ποιότητα σπέρματος με τη χρήση αυτοματοποιημένου συστήματος ανάλυσης σπέρματος (Computer Assisted Sperm Analysis). Παράλληλα, θα γίνει αξιολόγηση των επιπέδων φυλετικών στεροειδών (Τ, 11-ΚΤ, 17,20-β-DHP) στο αίμα των ψαριών που θα λαμβάνεται τις αντίστοιχες ημέρες μετά την ορμονική διαχείριση.
Εργασία 1.6 Αλλαγές στην σύσταση και ποιότητα αυγών κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου μετά από θεραπεία με ενέσεις και εμφυτεύματα GnRHa, και σε σχέση με την διατροφή των γεννητόρων (ΙΘΑΒΒΥΚ, ΑΡΓΟ, ΓΑΛΑΞΙΔΙ)
Το μαγιάτικο γεννά πολλαπλές φορές κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου και μετά από πρόκληση με GnRHa. Είναι χρήσιμο να αξιολογήσουμε την ποιότητα των παραγομένων αυγών σε σχέση με την σύσταση τους, ειδικά αφού το ψάρια συνήθως δεν τρέφονται κατά την διάρκεια της παραμονής του στις δεξαμενές ωοτοκίας, μετά την μεταφορά του από τους ιχθυοκλωβούς. Έτσι, γεννήτορες που διατηρούνται σε ιχθυοκλωβούς της εταιρείας ΑΡΓΟ καθ’όλη τη διάρκεια του έτους και τρέφονται με διαφορετικές τροφές, θα μεταφερθούν στις χερσαίες εγκαταστάσεις ωοτοκίας της εταιρείας, μετά από έλεγχο της αναπαραγωγικής τους κατάστασης και πρόκληση ωοτοκιας. Θα χρησιμοποιηθεί ίσος αριθμός ατόμων μεταξύ των διαφορετικών θεραπειών σε ίση αναλογία φύλου (1:1). Οι δεξαμενές και στις δύο εγκαταστάσεις θα είναι εφοδιασμένες με συλλέκτες αυγών, οι οποίοι θα ελέγχονται τρεις φορές κάθε μέρα. Όταν εντοπίζονται αυγά, θα συλλέγονται και θα αξιολογούνται για την ποιότητα τους (γονιμότητα, ποσοστό γονιμοποίησης, επιβίωση εμβρύων, εκκόλαψη, επιβίωση νυμφών). Παράλληλα, θα συλλέγεται δείγμα από κάθε διαφορετική ωοτοκία και θα μελετηθούν η ενεργειακή πυκνότητα, η περιεκτικότητα σε λίπη, πρωτεΐνες, υγρασία, τέφρα και λιπαρά οξέα.
Όλες οι αναλύσεις θα γίνουν σύμφωνα με τις προδιαγραφές της AOAC. Οι αναλύσεις θα γίνουν εις διπλούν. Η υγρασία θα προσδιοριστεί ζυγίζοντας μια ποσότητα 2.0 g θα ζυγιστεί με ακρίβεια 0.0001 g και θα τοποθετηθεί τοποθετήθηκε σε ξηραμένη κάψα σε κλίβανο 103±2°C για 16 h. Στη συνέχεια τα δείγματα αυγών θα λυοφιλιοποιηθούν για τις περαιτέρω αναλύσεις. Η τέφρα θα υπολογιστεί μέσω καύσης των αυγών σε κλίβανο στους 600°C για 7 ώρες. Το λίπος θα προσδιοριστεί με τη μέθοδο εκχύλισης που αναπτύχθηκε από τους Folch et al. (1957). Ο προσδιορισμός των λιπαρών οξέων θα βασιστεί στην μετατροπή των λιπαρών οξέων σε μεθυλ-εστέρες λιπαρών οξέων, οι οποίοι είναι πτητικοί και διαχωρίζονται σε αέριο χρωματογράφο. Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου και των πρωτεϊνών θα γίνει με τη μέθοδο Dumas, κατά την οποία 0.1 g δείγματος θα υποβληθεί σε σε καύση εντός θαλάμου υψηλής θερμοκρασίας (περίπου 900°C) παρουσία οξυγόνου. Ο προσδιορισμός της ενέργειας θα γίνει μέσω καύσης των αυγών σε θερμιδόμετρο και η αύξηση της θερμοκρασίας του νερού είναι ανάλογης της ενέργειας που περιέχεται στο δείγμα αυγών.
Εργασία 1.7. Διάχυση αποτελεσμάτων διαχείρισης γεννητόρων και αναπαραγωγής (ΙΘΑΒΒΥΚ)
Με βάση τα αποτελέσματα της ΕΕ 1 στο τέλος κάθε έτους, θα αξιολογούνται οι δράσεις διάχυσης αποτελεσμάτων, με την συγγραφή, σε πρώτη φάση, εκλαϊκευμένων άρθρων σε επαγγελματικά περιοδικά του τομέα, την παρουσίαση αποτελεσμάτων σε διεθνή και εθνικά συνέδρια και την ετοιμασία δημοσιεύσεων σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά.